Selezione di reference genes per la quantificazione dell'espressione genica mediante qRT-PCR in Salmonella enterica

Il seguente lavoro di ricerca è nato dall’esigenza di selezionare da un assortimento di geni housekeeping di un ceppo di Salmonella enterica, noto enteropatogeno, dei geni costitutivi tali da poter essere impiegati come standard interni al fine di permettere, negli studi che hanno ad oggetto la valutazione dell’espressione genica di geni target, dei risultati sperimentali di più elevata validità scientifica, in quanto dotati di un maggior grado di accuratezza e precisione.
Da alcuni anni a questa parte, l’utilizzo delle tecniche di diagnostica molecolare, tra cui la Real-Time PCR quantitativa, hanno trovato un crescente impiego, oltre che nella ricerca e nella diagnostica clinica, anche nella discriminazione molecolare dei microrganismi contaminanti le matrici alimentari e ambientali.
Trovare geni reference adatti che offrono la possibilità di valutare con un alto grado di sensibilità e specificità l’espressione genica non è un’impresa semplice, in quanto oltre a dover essere specie-specifici, devono possedere anche un elevato grado di stabilità genica, ossia, i geni che si intende utilizzare come standard interni per la quantificazione dell’espressione genica non devono risentire delle diverse condizioni sperimentali a cui sottoponiamo le nostre colture cellulari. Risulta quindi chiaro che, ad ogni condizione sperimentale e linea cellulare impiegata, si necessita di trovare almeno due o tre geni reference che appartengano alla linea cellulare in questione e che allo stesso tempo presentino un certo grado di stabilità nella/e condizione/i sperimentale/i utilizzata/e.
Questo accorgimento permette di ridurre al minimo gli errori sistematici, quali sottostime e sovrastime, durante le analisi molecolari effettuate attraverso metodologia qRT-PCR. Un buon valore di stabilità genica inoltre, permette una più accurata normalizzazione dei dati.
In questo studio è stata considerata una coltura cellulare omogenea di Salmonella enterica sottoposta a tre differenti condizioni sperimentali, oltre all’esposizione della stessa ad un antimicrobico naturale, nel nostro caso rappresentato dal timolo, un noto olio essenziale.